原标题：KGLP-1的研制和使用
胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)是由肠道L细胞排泄的一种肠肽激素,具有多种生理功能,有显着的血糖浓度依靠的影响胰岛素排泄作用,可以下降空腹和餐后血糖,在2型糖尿病的临床医治中具有较好的使用远景。但由于GLP-1在体内半衰期很短,被二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-Ⅳ)的快速降解和肾脏代谢作用,使其临床使用受到了很大约束。因而,开发更安稳的新式GLP-1类似物或缓释制剂,延伸其体内有用作用时刻己成为近年来重视的抢手课题。
首要构建纤维素结合域(CBD)与链霉亲和素(SA)的交融蛋白,制备了外表生物偶联SA的纤维素磁性微球(SA-CBD-MCMS),经过生物素(biotin)结合的Oligo(dT),建立了从细胞或安排中快速提取mRNA的办法,并从大鼠胰腺中提取mRNA,克隆了大鼠GLP-1受体(GLP-1R)。并将含有GLP-1R基因的重组表达载体pcDNA3.1(+)/GLP-1R转染含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的CHO/EGFP细胞,经抗性挑选、流式细胞分选和功能性剖析,得到了安稳转染的细胞系CHO/EGFP/GLP-1R。该功能性报告基因细胞剖析体系可以剂量依靠性的经过EGFP表达,对GLP-1R激动剂的体外活性进行定性定量剖析,为研讨、开发和点评长效GLP-1类似物奠定了根底。
研讨合成了含有31个氨基酸的新的GLP-1类似物KGLP-1,其结构是在天然GLP-1(7-37)酰胺的N端增加一个赖氨酸(Lys)。使用上述CHO/RGFP/GLP-1R细胞点评体系及克己DPP-Ⅳ粗酶液对KGLP-1的体外活性和安稳性进行剖析。成果显现,KGLP-1能以剂量依靠的方法激活GLP-1R,其EC50值(2.44 nmol/L)与天然GLP-1(0.83 nmol/L)比较略有升高；但KGLP-1具有显着的抗DPP-Ⅳ降解作用,与DPP-Ⅳ粗提物作用12 h后仍能坚持80％的活性。进一步体内活性剖析成果表明,KGLP-1能以剂量依靠的方法显着下降小鼠体内的血糖水平,在平等剂量下,给药2 h后仍具有显着的降血糖和促胰岛素排泄作用,而天然GLP-1在给药1 h后活性即消失。在糖尿病模型小鼠试验中,KGLP-1也相同显现出了显着的降血糖作用(p<0.01)。
研讨制备了KGLP-1与HSA的交融蛋白KGLP-1/HSA,并对其体内外活性、安稳性进行了剖析。体外剖析成果表明,KGLP-1/HSA具有与GLP-1相似的GLP-1R激动剂活性,EC50值为314 nmol/L,尽管其活性低于天然的GLP-1及类似物KGLP-1,但显现了显着的抗DPP-Ⅳ降解作用,12 h后仍能影响CHO/EGFP/GLP-1R细胞发生较强的荧光,其强度为本来的84％。体内活性剖析成果表明,尽管KGLP-1/HSA在给药后1 h才表现出显着的降血糖、促胰岛素排泄的作用,但这种活性可以保持8 h以上,而GLP-1与KGLP-1在给药1至2 h后作用即不显着。以上成果表明,经过与HSA的交融,KGLP-1/HSA能显着地减缓其体内代谢铲除率,延伸其体内作用时刻。
研讨对KGLP.1的打针缓释制剂进行了探究。使用复乳(W/O/W)溶剂挥发法制备了载KGLP-1的PLA和PLGA微球,别离调查了高聚物的品种、均匀分子量等要素对微球形状、均匀粒径、包封率和体外释药特性的影响。成果发现,该类微球的包封率都小于40％,药物丢失大。而选用S/O/O溶剂萃取法制备的载KGLP-1的PLGA长效打针微球其形状特征、包封率、体外释药均显现了较好的成果。电镜剖析显现微球外表相对润滑细密,巨细均一,均匀粒径为33.5μm,包封率为85.5％,微球初始6 h的突释为15.3％,14 d的累计开释总量到达69.5％。选用糖尿病模型大鼠皮下打针给药,对血糖和血清胰岛素水平的调查成果显现,载有KGLP-1的PLGA微球可以供给安稳的药物开释,完成了给药一次,缓释10 d,操控血糖、促进胰岛素排泄的作用。
以自行开发的SA-CBD-MCMS为东西,提取大鼠胰腺mRNA,克隆了大鼠GLP-1R。然后以GLP-1R为靶点构建了含有EGFP报告基因的功能性细胞剖析体系CHO/EGFP/GLP-1R,以此作为GLP-1R激动剂体外活性点评的细胞模型。使用该模型对新式GLP-1类似物KGLP-1及其与HSA的交融蛋白KGLP-1/HSA进行体外活性、安稳性点评,结合KM小鼠、糖尿病模型动物的体内试验,证明了KGLP-1作为一种新的抗DPP-Ⅳ降解的GLP-1类似物的有用性,并经过与HSA的交融,可以延伸其下降血糖、促进胰岛素排泄的作用时刻。一起,选用PLGA为包埋资料,S/O/O溶剂萃取法成功制备了载KGLP-1的缓释微球制剂,完成了长效医治的作用,为开发可以用于2型糖尿病临床医治的长效GLP-1类药物及其缓释制剂奠定了理论根底。
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